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孫可望的叛亂雖然平息，但是永曆政權的力量被極大地削弱，尤其是馬吉翔為代表的隱患並沒有被剷除。馬吉翔曾與孫可望勾結，為非作歹，李定國原本要逮捕馬吉翔，但馬吉翔託人找李定國說好話，並且極力地為李定國歌功頌德，騙取了李定國的信任，得以繼續留在永曆帝身邊。同時李定國在收編孫可望的軍隊時沒有一碗水端平，引起了軍內的不和。

1658年2月，清政府趁機以鐸尼為統帥，兵分三路大舉向貴州、雲南進攻。北路為平西王吳三桂；南路為都統卓布泰；中路為洪承疇、洛託。4月，南明政權的重要將領劉文秀病故。同月，孫可望的舊部王自奇在永昌叛變，李定國為了平息王自奇的叛亂，親率大軍徵討，在李定國徵討王自奇的同時，清軍已經攻陷了貴陽和重慶等地。7月永曆帝任命李定國為都招討大元帥應敵。李定國分兵三路進行阻擊，自己居中策應。但是他的黔西防線很快地被清軍突破，三路清軍攻入雲南，局勢已無可挽回。

李定國返回昆明召開了緊急軍事會議，雖然當時四川西南的宜賓、樂山、西昌一帶都還在南明控制之下，劉文秀曾留駐有3萬精兵；還可以聯絡到以原大順軍為主力的夔東十三家等抗清組織。但是李定國考慮到大順軍與大西軍並不融洽的關係，還是決定轉移到湖南和廣西交界與清廷繼續周旋。因為一旦形勢不利可向東南突進，與廈門的鄭成功部匯合；萬一失敗還可以出海，佔據島嶼與清朝繼續周旋。然而永曆帝畏敵如鼠，決定採取逃跑策略，遁入緬甸。10月15日，永曆帝撤出昆明逃往國外。1659年，白文選的殿後部隊被清軍擊敗。李定國毅然收拾殘兵，挑選了六千人埋伏在怒江以西的磨盤山，設下三道伏兵，果然，吳三桂的追兵渾然不知地鑽入了伏擊圈，不想在這關鍵的時候，南明官員盧桂生叛變向吳三桂通風報信，伏擊戰演變成為一場血戰，李定國部戰死2/3，許多老部下英勇戰死，當然清軍同樣是傷亡慘重，有十多名都統以下的軍官和幾千人戰死。吳三桂只得暫時放棄了追擊。

磨盤山血戰後，永曆帝及左右僚臣逃入緬甸境內與李定國失去了聯絡。李定國不肯入緬，在雲南西部召集潰散的部隊準備和清朝進行最後的戰鬥。李定國和白文選相會於木邦，派人去緬甸尋找永曆帝，他們派去的使者，被緬甸人所殺。緬甸以為南明軍隊已經是潰兵，想趁火打劫，搶劫明軍的軍馬。白文選大怒整頓人馬，命令進行反擊，緬軍主力（據文獻說有&ldo;數十萬&rdo;，可能失之誇張）在江對岸列陣，準備迎戰。明軍渡河進攻，僅百騎就擊潰緬軍，明軍順勢掩殺，據說斃傷緬軍萬人以上。緬甸官員搬出永曆帝要他勒令白文選退兵。

明將廣昌侯高文貴、懷仁侯吳子聖也曾率領一支兵馬入緬迎駕，李定國三十多次上表，想接回永曆帝，都被緬甸政府和永曆帝身邊的奸臣馬吉翔阻止。緬甸政府派兵把永曆帝軟禁了起來，為了救出皇帝，李定國曾經兩次起兵企圖入緬甸，因為種種原因而失敗。永曆帝身邊的忠臣沐天波組織的自救行動也被馬吉翔粉碎。許多的明軍將領和官員俱皆心灰意冷，紛紛向清朝投降，最後連白文選也投降了。唯有李定國一個人的意志從未動搖過。正應了一句話，&ldo;疾風知勁草，烈火識真金&rdo;。

1661年7月，吳三桂領十萬大軍開進緬甸，12月3日，緬甸國王向吳三桂交出了永曆帝，南明政權至此覆滅。李定國等曾密謀在吳三桂押解永曆帝去北京途中進行攔截。1662年4月，永曆帝在昆明被吳三桂殺害。

李定國聽說永曆帝遇害的訊息，萬分悲痛。李定國向東裡、暹羅借兵計劃失敗，同時軍中將士因為水土不服紛紛病倒，一連串的打擊接踵而來。1662年6月11日，李定國四十二歲生日這一天在百感交集、無限的鬱悶中也病倒了。6月27