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婦切奇利婭·加萊拉尼創作了《抱銀鼠的女子》。《抱銀鼠的女子》是達·芬奇傑出的肖像畫作品，體現了深厚的寫實功力。這幅精美的肖像畫，畫面人物氣質高貴沉靜，女郎懷抱的白貂毛色光潤，栩栩如生，充滿朝氣，充分體現了達·芬奇高超的繪畫技巧，而形態逼真的白貂使畫面生動了起來。這幅肖像畫最引人注目的地方是明暗的處理，畫家運用光線和陰影襯托出切奇莉亞優雅的頭顱和柔美的臉龐。
形神兼備，使得這幅肖像畫得到世人的推崇。
1500年達·芬奇回到佛羅倫薩，隨著共和國制度的恢復，文化氣氛一度活躍，畫壇上也先後出現了米開朗基羅、拉斐爾等傑出人物。達·芬奇開始為蘭則塔大教堂的主祭壇創作《聖母子與聖安娜、聖約翰》，他向市民展出的一幅經過精心構思的《聖母子與聖安娜、聖約翰》素描草圖，立即引起轟動，其構圖原理和畫法對藝術界有極大影響，米開朗基羅和拉斐爾等人也從中得到啟發。
1503年他一面著手為市政廳繪製壁畫《安吉里之戰》，一面創作《蒙娜麗莎》和《聖母子與聖安娜、聖約翰》（後稱為《聖母子與聖安娜》），這兩幅畫和《施洗者聖約翰》一起成為他極為珍愛的作品，始終帶在身邊，晚年移居法國也不離左右，最後遺存巴黎。1499年為躲避戰亂，達·芬奇在曼圖亞和威尼斯等地旅遊並進行一些科學研究。
達·芬奇晚年被法蘭西國王弗朗索瓦一世邀入法國，弗朗索瓦一世給予了他至高的接待，將其安置於昂布瓦斯城堡中的克魯克斯莊園，並時不時地去請教。1519年5月2日，年事已高的達·芬奇因病逝世了，據說他是在趕來的弗朗索瓦一世懷中嚥下了最後一口氣。
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